間充質(zhì)干細(xì)胞（mesenchymalStallcells，MSCs）作為一種成體干細(xì)胞，具有未分化細(xì)胞的特性，能高效率的自我更新，并且有著向多種成熟細(xì)胞分化的潛能。在生物醫(yī)學(xué)和組織工程中具有巨大的科研價值。骨髓是第一個被報道含有MSCs的組織來源，也是如今臨床應(yīng)用的主要來源，但獲取過程有創(chuàng)。易導(dǎo)致感染、出血、慢性疼痛，并且其增殖、分化潛能均隨年齡的增長而降低。因此對于老年患者的效果得不到保證。我國現(xiàn)已逐步進(jìn)入老齡化社會，臨床上帕金森?。≒arkinson’sdisease.PD）患者已達(dá)到200萬人。每年新增PD患者近20萬人。如不及時進(jìn)行有效的治療，患者病情呈慢性進(jìn)行性加重，晚期往往全身僵硬、活動受限，其中約30％的中晚期患者生活不能自理，最后死于各種并發(fā)癥閉。近年來，有研究者從人臍帶血（humanumbilical cord blood，HOCB）中分離出MSCs。并且成功將其分化為成骨、軟骨、脂肪等中胚層細(xì)胞及外胚層的神經(jīng)元131。由于臍血取材容易，來源豐富，免疫原性較弱。能耐受更大程度上的人類白細(xì)胞抗原配型不符等諸多優(yōu)勢，被眾多學(xué)者推薦為骨髓的替代來源。本文就臍血MSCs的分離及其效率、生物學(xué)特性、體外誘導(dǎo)分化情況以及移植治療PD前景做如下綜述。

    一、臍血的組成成份

    目前認(rèn)為，臍血中不但含有豐富的造血干細(xì)胞Oaematopoietic stemcells。HSCs），還存在多種非造血干細(xì)胞和前體細(xì)胞，如MSCs、內(nèi)皮前體細(xì)胞（endothelialprogenitor cells，EPCs）和非限制性體干細(xì)胞（unrestricted sonmtic stem cells，USSCs）等。Ingram等根據(jù)EPCs的克隆形成和增殖潛能。在EPCs中鑒定出一種新的細(xì)胞群并命名為高增殖潛能。I-IPP、ECFCs），這些細(xì)胞能夠完成超過100次群體倍增?？梢孕纬啥壓腿壖?，并保持很高的端粒酶活性。同時Kogler等發(fā)現(xiàn)，改變分離和培養(yǎng)條件，可使USSCs向MCSs方向轉(zhuǎn)化，且USSCs不表達(dá)透明質(zhì)酸酶。I（HASl），因此可將USSCs認(rèn)為是MSCs的早期中胚層前體細(xì)胞。也有學(xué)者采用X、Y染色體特異的DNA探針進(jìn)行熒光原位雜交發(fā)現(xiàn)。臍血里的MSCs來源于胎盤的胎兒面細(xì)胞。

    二、臍血MSCs分離及其效率

    迄今為止。足月的HUCB是否能成為分離多能MSCs的來源依然存在爭論。Wexler等在MSCs條件培養(yǎng)基里培養(yǎng)出來的第二代成纖維樣貼壁細(xì)胞CD45、CDl4呈陽性表達(dá)，而CD44、CD90、CD29陰性表達(dá)。由此得出結(jié)論：CB貼壁單核細(xì)胞具有的是HSCs形態(tài)學(xué)特征而非MSCs。隨后，越來越多的研究小組成功從足月HUCB中分離出MSCs，但大多由于HUCB中MSCs含量低（不超過骨髓含量的1／3），培養(yǎng)條件要求高，個體差異性大，導(dǎo)致分離成功率低下。Perdikogianni等在高接種密度、高樣本容量、高濃度成纖維細(xì)胞生長因子-2促分裂增殖的情況下。也只從25％HUCB樣本中分離出MSCs。并且原代培養(yǎng)時間長達(dá)34d，隨后需要55d才可繼續(xù)傳代。也有學(xué)者在排除孕齡和生產(chǎn)方式對MSCs獲得率的影響后得出分離培養(yǎng)臍血MSCs的最優(yōu)化條件：樣本處理時間≤15h、樣本量I>33mL、接種數(shù)≥103、胎牛血清包被培養(yǎng)瓶、無凝血、無溶血，成功率從28.8％提高到63％。已有報道證明早產(chǎn)兒臍血分離MSCs成功率明顯高于足月產(chǎn)，表明早產(chǎn)兒臍血中含有更多的MSCs，這可能與發(fā)育過程中造血部位向骨髓的遷移有關(guān)。另外，HUCB凍融易造成凝血，嚴(yán)重影響單核細(xì)胞的提取。幾乎得不到貼壁的MSCst“1?？傊绊慔UCB分離效果的因素很多，包括MSCs大小、表面粗糙程度、疏水性強(qiáng)弱、細(xì)胞彈性強(qiáng)弱等It21.目前的分離方法和技術(shù)尚不能達(dá)到像骨髓、脂肪、臍帶等來源MSCs的分離效率。因此，盡管HUCB來源豐富。但是不是以后MSCs臨床治療的有效來源依然是研究者爭論的焦點(diǎn)問題。

    三、臍血MSCs體外生物學(xué)特性

    原代培養(yǎng)的臍血MSCs表現(xiàn)的是一種混雜的細(xì)胞群。包括破骨樣細(xì)胞和成纖維樣細(xì)胞。破骨樣細(xì)胞顯微鏡下表現(xiàn)出形態(tài)多樣性。增殖能力有限，隨著傳代會被逐漸去除。而成纖維樣細(xì)胞（aPMSCs）鏡下表現(xiàn)為均一的雙極長梭形。胞體較骨髓MSCs稍小，成克隆樣生長。約3~4周可達(dá)到融合狀態(tài)，>85％的細(xì)胞處于早期靜止未分化狀態(tài)。具有很強(qiáng)的增殖分化潛能。有報道稱臍血MSCs體外可連續(xù)培養(yǎng)60代，并對前42代細(xì)胞進(jìn)行染色體組型分析發(fā)現(xiàn)長期培養(yǎng)的臍血MSCs仍可保持穩(wěn)定的染色體型（46.XY），意味著可以保留其原有的增殖分化及自我更新的能力。這是與骨髓MSCs相比最明顯的優(yōu)勢之一。

    目前臍血MSCs的鑒定主要是通過形態(tài)、功能以及在培養(yǎng)過程中出現(xiàn)的分化表型等分析，尚沒有直接的方法能鑒定臍血MSCs。但大多研究證明臍血MSCs陽性表達(dá)典型的MSCs表面標(biāo)志CD29、CD44、CD73、CD90、CDl05、CDl66以及于細(xì)胞標(biāo)志CDl33。陰性表達(dá)造血f細(xì)胞標(biāo)志CDlla、CDllb、CDl4、CD34、CD45tul。另外不表達(dá)MHC.Ⅱ類抗原及共刺激分子B7.1（CD80）。B7.2（CD86）和CD40／CD40L。故不能識別異體基因抗原，且由于缺少免疫激活信號傳導(dǎo)中兩條共同刺激通道，從而具有免疫耐受特性。

    四、臍血MSCs體外誘導(dǎo)分化

    關(guān)于臍血MSCs體外誘導(dǎo)分化的具體機(jī)制尚不明確。目前認(rèn)為主要與細(xì)胞外環(huán)境和細(xì)胞內(nèi)基因的選擇性表達(dá)有關(guān)。近年來。研究者對臍血MSCs體外定向誘導(dǎo)分化方法做了大量的研究。主要是通過細(xì)胞因子、生長因子、化學(xué)抗氧化劑改變細(xì)胞外局部微環(huán)境或者導(dǎo)入特定基因影響相關(guān)蛋白表達(dá)對分化進(jìn)行調(diào)控。Kogler等從臍血中分離的CD45一細(xì)胞體外不但可以分化成成骨細(xì)胞，軟骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞和造血細(xì)胞，用含有神經(jīng)生長因子mGF）、堿性成纖維生長因子（bFGF）、雙丁酰環(huán)磷酸腺苷（曲-cAMP）、異丁基甲基黃嘌呤（mMX）和維甲酸（RA）的培養(yǎng)基進(jìn)行誘導(dǎo)4周后發(fā)現(xiàn)，臍血MSCs也可跨胚層向神經(jīng)元分化。包括星形膠質(zhì)細(xì)胞和表達(dá)神經(jīng)微絲蛋白（NF）、鈉通道蛋白和多種神經(jīng)遞質(zhì)的成熟神經(jīng)元，并且有>30％的細(xì)胞酪氨酸羥化酶（TH）表達(dá)陽性。也有學(xué)者采用3步誘導(dǎo)法：[（1）胰島素一鐵傳遞蛋白一硒補(bǔ)充劑（ITS）、B27、bFGF、RA誘導(dǎo)l周；（2）ITS、B27、db.cAMP、抗壞血酸（從）誘導(dǎo)4d；（3）rrs、B27、forskolin、IBMX、AA誘導(dǎo)3d1成功誘導(dǎo)出成熟神經(jīng)元。并且RT.PCR檢測到中腦多巴胺（DA）能神經(jīng)元轉(zhuǎn)錄像關(guān)基因、Null、Ptx3、Pax2、Wntl和mRNA的表達(dá)，這為臍血MSCs移植治療PD提供了可能性。Greschat等舊用XXL條件培養(yǎng)基誘導(dǎo)臍血MSCs7d后神經(jīng)十細(xì)胞標(biāo)志DCX表達(dá)陽性率為（84.70+2.96）％。14d后早期神經(jīng)元標(biāo)志NF及pIII-mbulin表達(dá)陽性率分別達(dá)（63.10±2.15m和（61.10±2.52）％，21d即可檢測到成熟神經(jīng)元標(biāo)志突觸素（s”）和神經(jīng)元核fNeuN）的表達(dá)，在加入誘導(dǎo)劑DA4h后，TH陽性率從（32.0±1.9啪上升至（78.9±1.9）％，卻未見其他兒茶酚胺合成酶（DBH、PNMT）的表達(dá)，并且膜片鉗及高效液相檢測到大約68％的細(xì)胞可以通過L型鈣通道自發(fā)分泌DA及其在神經(jīng)元內(nèi)的代謝產(chǎn)物3，4.雙羥苯乙酸（DOPAC）和5.羥基吲哚乙酸（5.Hl從）。由此可見。臍血MSCs在體外不但可以分化出成熟的神經(jīng)元。還可定向分化為具有功能的DA能神經(jīng)元。預(yù)示著其治療PD的可能性。但是迄今為止也沒有體外完全分化成DA能神經(jīng)元的報道。而且不同的誘導(dǎo)方案分化率也不同。因此探索其分化的具體機(jī)制及建立穩(wěn)定的誘導(dǎo)方法是今后研究者們的主要方向。

    五、臍血MSCs移植治療PD的現(xiàn)狀

    目前，PD的治療主要包括內(nèi)科藥物治療、外科手術(shù)治療和于細(xì)胞移植治療。雖然藥物治療對于早期PD患者療效確切，能夠起到緩解癥狀的作用。但是都不能延緩本病進(jìn)展。達(dá)到根治的目的，而且隨著口服藥物時間的延長，疾病的自然進(jìn)展，單次藥物的劑量需要不斷加大。服用藥物的間隔時間不斷縮短，出現(xiàn)開關(guān)現(xiàn)象、藥物耐受現(xiàn)象等副作用：同時。長期服用還可以加重對中腦內(nèi)殘余DA能神經(jīng)元的損傷。PD的外科治療對于中晚期PD患者具有較好的療效。但是。核團(tuán)毀損術(shù)由于是破壞性手術(shù)，長期療效相對較差：腦深部電刺激（DBS）手術(shù)療效確切，有逐漸取代核團(tuán)毀損術(shù)的趨勢，然而，DBS的高昂價格又限制其能夠得到廣泛的應(yīng)用：同時，手術(shù)本身也存在著風(fēng)險。而且。無論是內(nèi)科治療還是外科治療。都只是緩解癥狀的手段。屬于對癥治療，并不能阻止和逆轉(zhuǎn)DA能神經(jīng)元的變性。直到干細(xì)胞移植理論和實驗研究的深入。才為PD的根本治愈提供了一種可能。臍血MSCs治療中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病不僅僅是發(fā)揮其替代作用，更重要的是可以提供神經(jīng)營養(yǎng)促使其自我修復(fù)。而且自體同源的臍血MSCs可以排除免疫排斥的副作用。大大提高移植的成功率。臍血MSCs移植治療創(chuàng)傷性腦損傷、脊髓損傷、腦缺血例及阿爾茨海默病1211已得到證實，并存在向臨床轉(zhuǎn)化的可能性。但是在PD的治療上尚處于探索階段，有學(xué)者用Hoechst33258標(biāo)記的臍血MSCs植入PD模型鼠的紋狀體，發(fā)現(xiàn)MSCs可在腦內(nèi)長期存活（>8周），并且有向病變區(qū)域遷移的趨勢。同時表達(dá)神經(jīng)元標(biāo)志物--神經(jīng)元特異性烯醇化酶、膠質(zhì)纖維酸性蛋白和TH，實驗組DA含量明顯高于對照組閻。這表明MSCs在大鼠腦內(nèi)微環(huán)境的作用下可模仿神經(jīng)干細(xì)胞的行為，沿著一定的路徑遷移，而且有向功能神經(jīng)元分化的潛能。也有學(xué)者將BrdU標(biāo)記的臍血MSCs注入岳羥多巴胺PD大鼠模型的右側(cè)紋狀體。發(fā)現(xiàn)移植組4周后阿樸嗎啡誘發(fā)的旋轉(zhuǎn)行為較對照組明顯減少（每30分鐘大鼠旋轉(zhuǎn)圈數(shù)分別為212±60、340±30）。差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<O.05），而且無一例大鼠意外死亡。由此可見。臍血MSCs移植可有效緩解PD癥狀。但是治療的具體機(jī)制目前尚未闡明。大多數(shù)學(xué)者傾向于認(rèn)為臍血含有豐富的多種干細(xì)胞，在人工培養(yǎng)條件下或者腦內(nèi)微環(huán)境誘導(dǎo)分化替代、修復(fù)退化的DA神經(jīng)元，進(jìn)而改善PD癥狀。另外，有研究證實臍血MSCs移植后。能促使神經(jīng)元突觸延伸至損傷位點(diǎn)。對殘余的神經(jīng)軸索起到保護(hù)作用，并刺激內(nèi)生的神經(jīng)前體細(xì)胞產(chǎn)生，說明其具有神經(jīng)保護(hù)和促神經(jīng)重建功能。

    越來越多的證據(jù)證明MSCs具有低免疫原性。更重要的是它同時也有免疫調(diào)節(jié)作用闡。樹突狀細(xì)胞（dendriticcells，DCs）是中樞免疫系統(tǒng)內(nèi)重要的抗原提呈細(xì)胞，臍血MSCs不但可呈濃度依賴性的抑制外周血單個核細(xì)胞的免疫反應(yīng)，還可促使DCs靜止在前體階段并誘發(fā)其凋亡；同時分泌II.-6導(dǎo)致DCs功能缺失閣，說明臍血MSCs同樣具有免疫調(diào)節(jié)作用?？勺鳛橥N異體移植有效防止免疫排斥反應(yīng)而保證存活率的良好種子細(xì)胞來源。國內(nèi)有學(xué)者證實中腦黑質(zhì)中a-synuclein的異常過度表達(dá)可大量激活DCs而加重該區(qū)域的炎癥反應(yīng)。從而導(dǎo)致DA能神經(jīng)元的凋亡冊，這也是PD的重要發(fā)病機(jī)制之一。如此說來，假如臍血MSCs移植能有效發(fā)揮其免疫調(diào)節(jié)特性。則可通過抑制中腦黑質(zhì)區(qū)的免疫炎性反應(yīng)有效緩解DA神經(jīng)元的凋亡。起到減慢PD發(fā)病進(jìn)程的作用。但目前國內(nèi)外尚無此類報道。這將是MSCs移植治療PD的一個新的突破口。

    盧國輝等，中華神經(jīng)醫(yī)學(xué)雜志，2012,11（3）：