腎間質(zhì)纖維化是慢性腎臟?。–HRoNIC KIdNEydISEASE，CKD）不斷進(jìn)展的共同病理改變，其程度和患者預(yù)后密切相關(guān)，但目前尚無有效的治療手段。

    由于CKD 起病隱襲，無論是在發(fā)達(dá)還是在發(fā)展中國家，很多患者在初次就診時(shí)就已經(jīng)步入CKD3 期或更嚴(yán)重的階段，此時(shí)多已存在相當(dāng)程度的腎間質(zhì)纖維化，喪失了應(yīng)用糖皮質(zhì)激素或免疫抑制劑等針對病因治療的時(shí)機(jī)，通常只能采取低蛋白飲食、血管緊張素Ⅱ活性抑制劑、降低血壓等一般性保守治療，而沒有更有效的針對性強(qiáng)的治療手段，多于數(shù)年后進(jìn)展到終末期腎衰竭，而不得不加入腎臟替代治療的行列，給個(gè)人和社會(huì)均帶來沉重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。

    因此進(jìn)一步解析腎間質(zhì)纖維化機(jī)制，尋求新的有效干預(yù)途徑，對降低終末期腎衰竭的發(fā)病率、減少巨額醫(yī)療開支，具有重要意義。

    隨著人類基因組測序工作的完成，研究人員逐漸從基因組學(xué)研究轉(zhuǎn)向研究生命的體現(xiàn)者蛋白質(zhì)的表達(dá)模式和功能模式，但蛋白質(zhì)在生命體內(nèi)又是動(dòng)態(tài)變化的，并存在多種翻譯后修飾，包括磷酸化、糖基化、泛素化、甲基化和乙?；刃揎?，其中糖基化是蛋白質(zhì)翻譯后修飾中最主要的修飾之一，對生命體起著至關(guān)重要的作用，人體內(nèi)50％以上的蛋白質(zhì)存在糖基化現(xiàn)象，糖基化對蛋白質(zhì)的折疊、運(yùn)輸、定位起著重要作用，蛋白質(zhì)的糖基化，特別是N連接糖基化普遍發(fā)生在細(xì)胞外環(huán)境的蛋白質(zhì)中，涉及到細(xì)胞免疫、蛋白翻譯調(diào)控、蛋白降解等許多疾病的病理過程。

    在腎病的炎癥、免疫紊亂的過程中均有糖類物質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能的改變，由于聚糖代謝酶類活力的改變或缺陷，可導(dǎo)致糖復(fù)合物中的糖鏈數(shù)量和結(jié)構(gòu)產(chǎn)生異常，最終導(dǎo)致腎臟細(xì)胞功能失常；

    糖鏈結(jié)構(gòu)異常還可能被機(jī)體免疫系統(tǒng)識別，引起細(xì)胞免疫和體液免疫應(yīng)答，并激發(fā)自身免疫反應(yīng)及免疫調(diào)節(jié)功能紊亂，介導(dǎo)細(xì)胞毒性反應(yīng)，引起腎臟細(xì)胞的損傷，所以糖復(fù)合物中糖鏈數(shù)量和結(jié)構(gòu)變化與腎病關(guān)系密切。本文試圖從糖生物學(xué)角度探討腎間質(zhì)纖維化的機(jī)制。

    一、信號通路在腎間質(zhì)纖維化作用概述

    腎臟的系膜細(xì)胞和成纖維細(xì)胞活化、小管上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)分化（EMT）、單核/巨噬細(xì)胞、T 細(xì)胞浸潤及細(xì)胞凋亡等細(xì)胞學(xué)事件促進(jìn)了腎纖維化的進(jìn)展。

    在這些過程中有多種細(xì)胞因子、生物活性物質(zhì)的參與共同激活了多種信號通路，如：轉(zhuǎn)化生長因子β1 （TGFβ1）/SMAd2 /3 通路、血小板源性生長因子（PDGF）/細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶（ERK）通路、無翅型蛋白（WNT）/β連環(huán)蛋白（βCATENIN）通路、鋸齒狀配體（JAGGEd，JAG）/翅缺痕蛋白（NoTCH）通路及大鼠肉瘤基因（RAS）通路等，多種信號通路的激活是腎間質(zhì)纖維化的核心，其中TGFβ1 激活的TGFβ/果蠅母代抗同源序列蛋白（SMAd）2 /3 通路是最為強(qiáng)力的致腎間質(zhì)纖維化信號通路，是近20 年來研究最為深入的致纖維化通路，其經(jīng)典的激活過程是TGFβ1 首先與其Ⅱ型受體中的TGFβRII 結(jié)合，磷酸化TGFβRII，形成具有活性的“（TGFβRII）（TGFβ1）”復(fù)合物，使Ⅰ型受體TGFβ RI 中的激活素受體樣激酶（ALK）4、ALK5、ALK7 磷酸化，形成“（TGFβRII）（TGFβ1 ）（TGFβRI）”三元復(fù)合物，激活下游的功能蛋白SMAd2 /3 或SMAd7，磷酸化的SMAdS 進(jìn)入細(xì)胞核，啟動(dòng)纖維化過程。

    理論上推測，阻斷或降低上述TGFβ的“致纖維化”信號傳導(dǎo)通路活性可能成為有臨床前景的治療腎間質(zhì)纖維化的途徑。

    事實(shí)上，從10 余年前已經(jīng)有學(xué)者開始這方面的努力：研究表明，抗TGFβ單克隆抗體、反義TGFβ1 寡核苷酸、天然的TGFβ抑制劑均能下調(diào)TGFβ表達(dá)，成功地減輕了實(shí)驗(yàn)動(dòng)物腎臟纖維化，但由于上述方法同時(shí)也非選擇性地抑制了TGFβ其它功能，可以導(dǎo)致發(fā)育異常、生長、免疫功能異常等難以克服的副作用，至今未能向臨床應(yīng)用拓展。

    近來，學(xué)者們將目光轉(zhuǎn)向?qū)GFβ/SMAd2 /3 下游通路的調(diào)節(jié)上，受體蛋白TGFβRII 是其激活的關(guān)鍵下游環(huán)節(jié)，沒有該受體蛋白的活化，該通路就無法激活，對它的調(diào)節(jié)有望在抑制通路激活的同時(shí)，避免阻斷TGFβ1 所帶來的副作用。

    已經(jīng)有研究嘗試通過下調(diào)或沉默TGFβRII 基因表達(dá)、抑制TGFβI 型受體中ALK5 的磷酸化來下調(diào)TGFβ“致纖維化”通路的活性，有效地抑制了動(dòng)物模型的纖維化。

    上述研究的結(jié)果說明了通過受體水平干預(yù)該通路活性對纖維化抑制的可行性和有效性，但目前仍在實(shí)驗(yàn)室研究階段。

    二、腎間質(zhì)纖維化的糖生物學(xué)研究進(jìn)展

    近年來的功能性糖蛋白組學(xué)在重大疾病的診斷標(biāo)志物和新藥靶目標(biāo)方面研究的巨大進(jìn)展和廣闊的應(yīng)用前景，為我們提供了一個(gè)新的研究途徑。

    由于TGFβ“致纖維化”通路中兩個(gè)關(guān)鍵起始受體TGFβRII 和ALK5 是糖蛋白，大連醫(yī)科大學(xué)腎臟病研究所課題組推測糖基化修飾對它們致纖維化功能可能有關(guān)鍵作用。

    WANG 等利用α1，6 巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶（α1，6FUCoSylTRANSFERASE，F(xiàn)UT8）基因敲除小鼠直接有力地支持了這一推測：該研究結(jié)果表明TGFβRII 是由FUT8 催化的核心巖藻糖基化修飾的，沉默F(xiàn)UT8 使得TGFβRII 糖基化修飾不能進(jìn)行，導(dǎo)致“TGFβ1 /TGFβRⅡ/SMAd2 /3”通路不能活化，發(fā)生肺氣腫樣改變。

    受這項(xiàng)研究工作的啟示，大連醫(yī)科大學(xué)腎臟病研究所課題組首次探討了腎間質(zhì)纖維化過程中，核心巖糖基化修飾通過修飾TGFβRII 對腎間質(zhì)纖維化過程的影響，以此來探索糖生物學(xué)在腎間質(zhì)纖維化中作用。

    （一）糖基化修飾在腎間質(zhì)纖維化中作用的體外實(shí)驗(yàn)研究

    在體外實(shí)驗(yàn)中，大連醫(yī)科大學(xué)腎臟病研究所課題組選用了人腎小管上皮細(xì)胞株2 （HUMAN KIdNEy2，HK2）細(xì)胞進(jìn)行研究，首先用免疫熒光的方法確定HK2 細(xì)胞的胞漿和細(xì)胞表面均有中等量核心巖藻糖鏈的表達(dá)。

    然后，用5 NG/Ml TGFβ1 刺***K2 細(xì)胞48 H，結(jié)果發(fā)現(xiàn)TGFβ1 **后，HK2 細(xì)胞的核心巖藻糖基化水平明顯升高，這提示核心巖藻糖基化修飾可能在促進(jìn)TGFβ1 誘導(dǎo)的TGFβ/SMAd2/3 通路激活中發(fā)揮作用。

    TGFβRII 與ALK5 是TGFβ/SMAd2/3 信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的關(guān)鍵受體蛋白，為確定TGFβRII 與ALK5 與核心巖藻糖基化的關(guān)系，他們用異硫氰酸熒光素（FITC）小扁豆凝集素（LCA）與TGFβRII 或ALK5 進(jìn)行免疫熒光測定蛋白與核心巖藻糖鏈的空間表達(dá)表位關(guān)系，結(jié)果顯示腎小管上皮細(xì)胞中TGFβRII，ALK5 與核心巖藻糖鏈的表達(dá)表位完全重合，提示TGFβRII 及ALK5 受體蛋白均受到核心巖藻糖基化的修飾。

    接著，他們通過基因沉默的方法沉默了FUT8 基因后，檢測TGFβ/SMAd2 /3 通路上TGFβRII 和ALK5 的變化。

    結(jié)果發(fā)現(xiàn)FUT8SIRNA 明顯降低TGFβRII 和ALK5 的核心巖藻糖基化水平；如前所述，受體TGFβRII 和ALK5 正常發(fā)揮功能是TGFβ/SMAd2 /3 通路激活的必要條件，那么，它們核心巖藻糖基化的缺失對其維持TGFβ/SMAd2 /3 通路激活的功能有什么影響呢？

    他們測定了TGFβ/SMAd2 /3 通路的活性，發(fā)現(xiàn)FUT8SIRNA 抑制了TGFβ1 誘導(dǎo)的PSMAd2 /3 的表達(dá)升高及其核轉(zhuǎn)位，這表明在腎小管上皮細(xì)胞中，F(xiàn)UT8SIRNA 通過抑制TGFβRII 和ALK5 的核心巖藻糖基化修飾而抑制TGFβ/SMAd2 /3 通路的激活，提示核心巖藻糖基化修飾是TGFβRII 和ALK5 發(fā)揮功能必需的。

    接下來，他們采用5 NG/Ml 的TGFβl 無血清刺***K2 細(xì)胞48 小時(shí)后，相差顯微鏡下觀察HK2 細(xì)胞形態(tài)的變化，發(fā)現(xiàn)HK2 細(xì)胞失去了原來的鵝卵石樣形態(tài)，細(xì)胞呈現(xiàn)長梭形，細(xì)胞間隙擴(kuò)大，排列紊亂，其上皮細(xì)胞表型特異性標(biāo)志物ECAdHERIN 的表達(dá)出現(xiàn)了明顯的下調(diào)，而肌成纖維細(xì)胞特異性表型α平滑肌肌動(dòng)蛋白（SMooTH MUSClEACTIN，SMA），N鈣粘素（CAdHERIN），成纖維細(xì)胞特異蛋白1 （FIbRoblAST SPECIFIC PRoTEIN1，F(xiàn)SP1）的表達(dá)則明顯上調(diào)，提示TGFβl 成功誘導(dǎo)體外培養(yǎng)的HK2 細(xì)胞出現(xiàn)EMT。

    提前孵育FUT8SIRNA 能有效抑制E鈣粘素的表達(dá)降低，同時(shí)阻止αSMA，N鈣粘素以及FSP1 的表達(dá)升高。他們還發(fā)現(xiàn)，TGFβ1**細(xì)胞能明顯導(dǎo)致細(xì)胞凋亡，而提前孵育FUT8SIRNA 24 H能有效的阻止TGFβ1 誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。

    該課題組的研究第一次展示了核心巖藻糖基化修飾對TGFβ1 誘導(dǎo)的腎小管上皮細(xì)胞損傷中TGFβ/SMAd2 /3 信號通路活化的影響，并進(jìn)一步抑制腎小管上皮細(xì)胞的EMT。

    研究成果發(fā)表在美國生理學(xué)雜志上。為了進(jìn)一步驗(yàn)證以上發(fā)現(xiàn)，該課題組建立了單側(cè)輸尿管梗阻（UUO）腎間質(zhì)纖維化大鼠體外實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?，利用腺病毒FUT8SHRNA 有效的抑制大鼠腎間質(zhì)組織中核心巖藻糖鏈的表達(dá)，觀察腎小管間質(zhì)中TGFβR 受體核心巖藻糖鏈的變化與腎間質(zhì)纖維化的關(guān)系。

    結(jié)果發(fā)現(xiàn)，隨著模型大鼠腎間質(zhì)纖維化的加重，腎小管間質(zhì)中的核心巖藻糖鏈表達(dá)水平逐漸上調(diào)，而注射腺病毒SHRNA 抑制大鼠FUT8 表達(dá)，能抑制TGFβRI 及TFGβRII 的核心巖藻糖基化修飾，進(jìn)而抑制UUO 大鼠模型中的TGFβ/SMAd2 /3 信號通路的激活，作為這種分子干預(yù)的結(jié)果，UUO 模型中腎間質(zhì)纖維化被顯著抑制。

    值得注意的是，體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)均發(fā)現(xiàn)，在干預(yù)糖基化修飾過程中，TGFβR 表達(dá)水平并沒有受到影響。研究結(jié)果首次證實(shí)了腎間質(zhì)纖維化過程中TGFβR 的核心巖藻糖基化修飾發(fā)揮了關(guān)鍵性的作用，并發(fā)現(xiàn)其作用不依賴于所修飾蛋白本身的表達(dá)。

    研究結(jié)果發(fā)表在國際腎臟病雜志，美國德克薩斯州大學(xué)病理系教授ManjeriA及美國密西根大學(xué)醫(yī)學(xué)部教授Joel M為該研究撰寫了專欄述評，述評指出作者檢測到在腎臟損傷模型中，利用糖生物學(xué)方法能夠及時(shí)、有效、顯著的抑制TGFβ通路并阻斷腎間質(zhì)纖維化進(jìn)程，這一發(fā)現(xiàn)非常新穎，為腎臟中TGFβ通路調(diào)節(jié)的研究添加了新的啟示，這是首次以嶄新的視角檢測TGFβ受體功能并為未來的研究打下了基礎(chǔ)。

    （二）蛋白尿致腎間質(zhì)纖維化的糖生物學(xué)機(jī)制

    上述研究只是從單一信號通路角度探討腎間質(zhì)纖維化的糖生物學(xué)機(jī)制，而臨床上往往是多因素共同作用促進(jìn)腎間質(zhì)纖維化，蛋白尿就是一種能激活多個(gè)促纖維化通路的病理過程。

    研究證實(shí)，蛋白尿可作為一個(gè)***的病理因素直接導(dǎo)致腎間質(zhì)纖維化的發(fā)生，它已經(jīng)成為預(yù)測慢性腎臟病的不良預(yù)后最強(qiáng)烈的危險(xiǎn)因素，但其導(dǎo)致腎間質(zhì)纖維化的具體機(jī)制并不十分清楚。

    大連醫(yī)科大學(xué)腎臟病研究所課題組試圖在以往基礎(chǔ)上進(jìn)一步探討糖基化修飾在蛋白尿?qū)е履I間質(zhì)纖維化過程中的作用。

    腎小管上皮細(xì)胞能通過位于腎小管刷狀緣上的MEGAlIN 受體聯(lián)合CUbIlIN 過度內(nèi)吞尿蛋白，導(dǎo)致腎小管上皮細(xì)胞氧化應(yīng)激、炎癥損傷，進(jìn)而促進(jìn)腎間質(zhì)纖維化發(fā)生，MoToyoSHI 等報(bào)道，當(dāng)小鼠腎小管上皮細(xì)胞的MEGAlIN 基因被敲除后，腎小管無法吸收白蛋白，炎癥反應(yīng)減弱，小鼠腎間質(zhì)纖維化減輕；

    而表達(dá)MEGAlIN 的腎小管上皮細(xì)胞的單核/巨噬細(xì)胞趨化蛋白（MoNoCyTE /MACRoPHAGE CHEMoTACTIC PRoTEIN1，MCP1）增加，炎癥損傷加重，小鼠腎間質(zhì)纖維化明顯。因此，MEGAlIN 被認(rèn)為是尿蛋白超負(fù)荷導(dǎo)致炎癥反應(yīng)的決定性因素。

    結(jié)構(gòu)研究表明，MEGAlIN 屬于糖蛋白，它受到核心巖藻糖基化的修飾。因此，推測核心巖藻糖基化修飾能夠影響MEGAlIN 吸收蛋白的功能。

    為觀察FUT8 基因轉(zhuǎn)染后腎小管上皮細(xì)胞中MEGAlIN 綁定和內(nèi)吞白蛋白的變化，課題組首先用免疫熒光雙染測定MEGAlIN 是否受到核心巖藻糖基化的修飾，結(jié)果顯示MEGAlIN 與核心巖藻糖鏈的表達(dá)表位完全重合，這提示，MEGAlIN 蛋白的確受到核心巖藻糖基化的修飾。

    推測MEGAlIN 與白蛋白結(jié)合能力很可能受其核心巖藻糖基化修飾的影響，為證實(shí)這一設(shè)想，他們進(jìn)一步利用共聚焦顯微鏡及流式細(xì)胞術(shù)分析白蛋白的結(jié)合和內(nèi)吞，二者結(jié)果顯示抑制MEGAlIN 的核心巖藻糖基化能減少腎小管上皮細(xì)胞對白蛋白的結(jié)合和內(nèi)吞，反之則能增加腎小管上皮細(xì)胞對白蛋白的結(jié)合和內(nèi)吞，這提示MEGAlIN 的核心巖藻糖基化修飾是其結(jié)合和內(nèi)吞白蛋白所必需的。

    為觀察MEGAlIN 核心巖藻糖基化在白蛋白超負(fù)荷炎癥損傷過程中的作用，他們首先用瞬時(shí)轉(zhuǎn)染的方法將FUT8SIRNA 片段以及高表達(dá)FUT8 基因載體質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞成功干擾了FUT8 目的基因。

    進(jìn)一步檢測了FUT8 基因沉默及過表達(dá)后炎癥趨化因子MCP1 和受激活調(diào)節(jié)正常T 細(xì)胞表達(dá)和分泌因子（RANTES）的表達(dá)變化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)UT8 基因的高表達(dá)能明顯上調(diào)MCP1、RNATES 表達(dá)水平，而沉默F(xiàn)UT8 基因能明顯下調(diào)MCP1、RANTES 表達(dá)。

    有研究表明，炎癥趨化因子MCP1 及RANTES 的釋放是白蛋白內(nèi)吞依賴性的，而沉默了MEGAlIN 的核心巖藻糖基化能減少白蛋白的內(nèi)吞，所以，沉默了MEGAlIN 的核心巖藻糖基化，能減少細(xì)胞對白蛋白的內(nèi)吞而使炎癥趨化因子MCP1，RANTES 的表達(dá)下降，從而抑制了腎小管上皮細(xì)胞的炎癥損傷反應(yīng)。

    這提示MEGAlIN 的核心巖藻糖基化修飾參與了白蛋白導(dǎo)致的腎小管上皮細(xì)胞的炎癥損傷過程，阻斷MEGlAIN 的核心巖藻糖基化修飾就能阻斷白蛋白導(dǎo)致的腎小管上皮細(xì)胞的炎癥損傷。

    本實(shí)驗(yàn)中，首次發(fā)現(xiàn)核心巖藻糖基化修飾是MEGAlIN發(fā)揮結(jié)合和內(nèi)吞功能所必需的，揭示了腎小管結(jié)合和吸收蛋白過程中核心巖藻糖基化修飾的調(diào)控機(jī)制。

    此外，還發(fā)現(xiàn)抑制MEGAlIN 的核心巖藻糖基化能阻斷白蛋白過度吸收導(dǎo)致的腎小管上皮細(xì)胞炎癥損傷，這為臨床上抗蛋白尿損傷提供了新的思路，同時(shí)揭示了蛋白尿與糖基化修飾二者之間的聯(lián)系。以上研究，從糖生物學(xué)角度初步探討了腎間質(zhì)纖維化的糖生物學(xué)機(jī)制，為我們更深入的了解腎間質(zhì)纖維化，尋找抗慢性腎臟病進(jìn)展的策略，提供了新的視角。